Hemoqlobinopatiyaların laborator diaqnostikası

GİRİŞ.

İnsan hemoqlobini (Hb) iki cüt fərqli qlobin zəncirindən ibarət tetramer proteindir.

Quruluşunda fərqinə görə hazırda mindən çox hemoqlobin növü aşkar edilib və bunlar hemoqlobinopatiyalar adlanır. Bu hemoqlobinopatiyaların böyük əksəriyyəti sağlamlığa heç bir təhdid yaratmır, heç bir kliniki və ya hematoloji problemə səbəb olmur. Lakin hemoqlobinopatiyaların bəziləri müxtəlif dərəcəli xəstələnmə hallarına və hətta ölümə səbəb ola bilər (məs., oraqvari hüceyrə anemiyası, böyük beta talassemiya (beta talassemiya major)).
Burada müxtəlif hemoqlobinopatiyaların laborator diaqnostikası müzakirə ediləcəkdir.

 

QLOBİN ZƏNCİRİNİN FİZİOLOGİYASI.
Burada qlobin genin fiziologiyası qısa müzakirə ediləcəkdir. Qlobin genləri hələ dölün inkişafının 4-6-cı həftəsində ekspressiya olunmağa başlayır. Dölün alfa-zəncirinə bənzər zəncirləri zeta-zəncirlər (ζ) adlanır, betta-zəncirə bənzər qlobin zəncirləri isə epsilon-zəncirlər (ε) adlanır. Bu zəncirlərin tetramerləri dölün üç Hemoqlobin növünün əmələ gəlməsinə səbəb olur: Qover-1 Hb (ζ2ε2), Qover-2 (α2ε2) və Portland Hb (ζ2γ2). Bu embrional hemoqlobinlər gestasiya dövrünün 8-ci həftəsi yoxa çıxır.
Alfa-qlobin zəncirinə bənzər və beta-qlobin zəncirinə bənzər qlobin zəncirlərini kodlaşdıran genlər müxtəlif xromosomlarda klasterlərdə yerləşir. Alfa-qlobin zəncirini kodlaşdıran genlər klasteri 16-cı xromosomun qısa qolunda (16p13.3) və beta qlobin zəncirini kodlaşdıran genlər klasteri 11-ci xromosomun qısa qolunda (11p15.5) yerləşir.
İnkişafın bütün mərhələlərində alfa və beta zəncirlərin sintezi balanslaşdırılmış olur. Beləliklə, normada hansısa qlobin zənciri digərindən artıq miqdarda sintez olunmur. Bu balansın pozulması talassemiya sindromlarının əsas əlamətidir.
Hemoqlobinopatiyalar qlobin sintezinin pozulması nəticəsində əmələ gəlir və hemoqlobinin variantları (keyfiyyət) və hemoqlobin zəncirlərinin miqdarına (kəmiyyət) görə iki geniş sinfə bölünür.

 

Hemoqlobinopatiyaların yayılması dərəcəsi.
Dünyanın bəzi coqrafi bölgələrində alfa- və beta-talassemiya çox geniş yayılmış olur (məsələn, Afrika və Hindistanda bəzi əhali qrupları arasında HbS-in yayılması 30-35% yaxın ola bilər). Azərbaycanda talassemiya nisbətən geniş yayılmış xəstəlikdir. Belə ki, Azərbaycan Genetik Diaqnostika Mərkəzinin məlumatına görə Azərbaycan əhalisinin 8% talassemiya genin daşıyıcısıdır. Azərbaycanın da qlobal iqtisadi miqrasiyada yer aldığını nəzərə alaraq, digər ölkələrə xas olan hemoqlobinopatiyaların burada da sayının artması son illərdə müşahidə edilməkdədir. Avropa ölkələrində də əhalinin miqrasiyası səbəbindən müxtəlif hemoqlobinopatiyaların əhali arasında yayılması dərəcəsi artmaqdadır.

 

İctimai səhiyyə məsələləri. Hemoqlobinopatiyalar ən çox yayılmış irsi xəstəliklərdir. Hemoqlobinopatiyaların bu cür yayılması falciparum malaria xəstəliyinin geniş yayılması nəticəsində Afrika kontinentində əhali arasında baş verən genetik seleksiyadan qaynaqlanır.
HbS və beta-talassemiya ilə bağlı heteroziqotluq malariyaya qarşı qoruyucu funksiya daşıyır. Lakin, HbS və beta-talassemiya ilə bağlı homoziqotluq, habelə HbS, HbC, HbE və beta-talassemiya allelərinin müxtəlif növlərinə görə ümumi heteroziqotluq isə kliniki cəhətdən əhəmiyyətli pozuntulara səbəb olur və səhiyyə resursları zəif olan ölkələrdə ciddi ictimai səhiyyə probleminə çevrilir. Son dekadalarda dünya əhalisinin miqrasiyası ona gətirib çıxarıb ki, hemoqlobinopatiyalar hazırda bütün qitələrdə və xüsusilə də, qərb ölkələrində tez-tez təsadüf etməyə başlayıb.

 

-----------------------------------------------------------------------------------
Cədvəl 1. Kliniki əhəmiyyətə malik hemoqlobin mutasiyaları.
  • Oraqvari hüceyrə sindromları (polimerizasiyanın pozulması).
    • Homoziqot oraqvari hüceyrə xəstəliyi (HbSS)
    • Oraqvari hemoqlobin C (HbSC)
    • Oraqvari-betta talassemiya
  • Talassemiya xəstəlikləri - normal qlobin zəncirinin sintezinin azalması.
  • Talassemiya fenotipinə səbəb olan hemoqlobin molekulunun quruluşuna təsir edən mutasiyalar (Hb Lepore, Constant Spring, HbE)
  • Həll olunma qabiliyyətinin azalması (kristallizasiya, HbC xəstəliyi)
  • Qeyri-stabil hemoqlobinlər (anadangəlmə Haynz cismli hemolitik anemiya, Hb Koln)
  • Oksigenə birləşmə bacarığının pozulmasına təsir edən mutasiyalar:
    • Oksigenə yüksək yaxınlıq (birləşmə bacarığı) (irsi eritrositoz, Hb Chesapeake)
    • Oksigenə az yaxınlıq (birləşmə bacarığı) (irsi sianoz, Hb Kansas)
  • M-hemoqlobinlər (irsi sianoz/anadangəlmə methemoqlobinemiya).
-----------------------------------------------------------------------------------

 

QLOBİN ZƏNCİRİNİN MUTASİYALARI.
Bu günə qədər hemoqlobinin mindən çox müxtəlif variantları müəyyən edilib. Hemoqlobinin müxtəlif variantlarının əksəriyyəti kliniki və hematoloji cəhətdən heç bir problem yaratmır və daha çox biokimyaçılar və genetiklər üçün maraq kəsb edir.
Hemoqlobin variantlarının əksəriyyəti qlobin proteinlərini (α, β, γ, və ya δ) kodlaşdıran genlərdə tək nukleotidin əvəzlənməsi nəticəsində baş verən nöqtəvi (eng. missense) mutasiya səbəbindən yaranır. Digər az təsadüf edən mexanizmlər aşağıdakılardır:
  • Bir və ya daha çox nukleotidlərin silinməsi və ya əlavə edilməsi nəticəsində genin oxunmasının dəyişməsi (məs., Hb Geneva betta114 - CT, +G).
  • Genlərarası DNT ardıcıllığının silinməsi ilə müşaiyət olunan yanaşı qlobin genlərinin birləşməsi (eng. fusion).

 

-----------------------------------------------------------------------------------
Cədvəl 2. İnsanın normal inkişafı boyu hemoqlobinin dəyişməsi.
  • Döldə:
    • Hemoqlobin F (α2γ2).
  • Postnatal dövrdə:
    • Hemoqlobin A (α2β2): ən çox təsadüf edən hemoqlobin növüdür (95%)
    • Hemoqlobin A2 (α2δ2): δ-zəncirinin sintezi üçüncü trimestrin sonunda başlayır; yaşlı insanda HbA2-nin səviyyəsi 1.5-3.5% təşkil edir.
    • Hemoqlobin F (α2γ2): yaşlılarda HbF yalnız F-hüceyrələr deyilən qırmızı qan hüceyrələrində müşahidə edilir. Lakin, oraqvari hüceyrə xəstəliyi və beta-talassemiyası olan xəstələrdə HbF səviyyəsi artmış olur.
-----------------------------------------------------------------------------------

 

Kliniki fəsadlar.
Hemoqlobinin quruluşu, stabilliyi, sintezi və ya molekulun funksiyasını əhəmiyyətli dərəcədə pozan hemoqlobin variantları hematoloji və/və ya kliniki fəsadlara səbəb olur. Həmin fəsadlar aşağıdakı spesifik kateqoriyalara bölünür:
  • Hemoqlobinin fiziki xüsusiyyətlərinin dəyişməsi. HbS və HbC variantlarının əmələ gəlməsi hemoqlobin molekulunun səthində baş verən mutasiyalarla bağlıdır. Bu mutasiyalar hemoqlobin molekulunun (elektrik) yüklənməsini dəyişdiyi üçün hemoqlobin molekulunun fiziki və kimyəvi xüsusiyyətləri də dəyişmiş olur. Buna görə də HbS variantında deoksigenasiya (və ya oksigenin azlığı) zamanı Deoksihemoqlobin S qeyri-normal polimerin formalaşmasına gətirib çıxarır. HbC variantında isə hemoqlobin molekullarının kristallaşması baş verir. Hər iki pozuntu qırmızı qan hüceyrələrinin funksiyası, morfologiyası, reologiyası və fəaliyyət müddətinə ciddi təsir göstərmiş olur.
  • Qlobinin qeyri-stabilliyi. Qeyri-stabil hemoqlobin variantlarının patogenezi bir sıra mexanizmlərlə bağlıdır. Ən geniş yayılmış mexanizm qeyri-stabil hemoqlobin molekulunun qırmızı qan hüceyrəsi daxilində çökməsidir. Bu zaman çökmüş hemoqlobin molekulu qırmızı qan hüceyrəsinin membranasının daxili qatına bitişmiş olur (buna "Haynz cismi"nin formalaşması deyilir). Beləliklə, eritrositlərin daxili membranasına bitişmiş olan Haynz cismləri daşıyan qırmızı qan hüceyrələrinin deformasiyaya (formasının dəyişməsi) uğrama qabiliyyəti pozulmuş olur ki, bu da onların tez dağılmasına gətirib çıxarır (məs., anadangəlmə Haynz cismli hemolitik anemiya).
  • Oksigenə yaxınlıq (birləşmə) qabiliyyətinin pozulması. Müəyyən qlobin zəncirlərində baş verən mutasiyalar hemoqlobin molekulunun oksigeni birləşdirmə qabiliyyətinə təsir etmiş olur. Hemoqlobin molekulunun oksigeni birləşdirmə bacarığının artması toxumalarda oksigenin hemdən ayrılmasına maneə törədir. Bu səbəbdən müxtəlif orqanlarda və, xüsusilə də, böyrəklərdə oksigen çatışmazlığı yaranır və böyrəklər buna eritropoetin hormonun artmış sekresiyası ilə cavab verir. Nəticədə isə xəstələrdə eritrositoz və ya qırmızı qan hüceyrələrinin mütləq kütləsinin artması müşahidə edilir. Digər növ mutasiyalar nəticəsində hemoqlobin molekulunun oksigeni birləşdirmə qabiliyyəti azalmış olur. Bu səbəbdən də həm toxumalara daşınan oksigenin miqdarı az olur (çünki hemoqlobin daha az oksigen birləşdirmiş olur), həm də toxumalarda oksigen hemdən daha asan ayrılır və toxumalara keçir. Bu isə bəzi hallarda sianoz və anemiyaya səbəb olur.
  • Hem dəmirinin oksidləşməsi. Hemin bəzi mutasiyaları dəmir atomunun ferroz (Fe++) haldan ferrik (Fe+++) hala keçməsi ilə nəticələnən oksidləşməsinə səbəb olur. Bunun nəticəsində methemoqlobinemiya (M-hemoqlobinlər) və sianoz inkişaf edir.
  • Quruluşun və sintetik funksiyanın pozulması. Bəzi mutasiyalar həm qlobin zəncirinin quruluşu, həm də sintetik reaksiyaların sürətinin pozulmasına səbəb olur və "talassemiya" fenotipinin yaranması ilə nəticələnir.

Normal və qeyri-normal hemoqlobin variantlarının ekspressiyası.
Geniş yayılmış bəzi hemoqlobin variantları (məs., HbS, HbC, HbE və HbD-Los Angeles) istisna olmaqla, çox nadir qeyri-normal hemoqlobin variantları homoziqot halda müşahidə edilir. Ümumiyyətlə, qeyd edilməlidir ki, hemoqlobinin əksər variantları heteroziqot vəziyyətdə müəyyən edilir. Lakin, mutasiyanın harada baş verdiyindən asılı olaraq (alfa, beta və ya qamma qlobin genlərində), onların ekspressiyası da fərqli olur:
  • Qamma zəncirin variantları döldə müəyyən edilir və onun ekspressiyası döl inkişaf etdikcə tədricən azalır. Belə ki, qamma zəncirləri tədricən beta qlobin zənciri ilə əvəzlənir.
  • Alfa qlobin zəncirinin variantları döldə, neonatal dövrdə və yaşlı insanlarda ekspressiya olunur.
  • Beta qlobin zəncirinin variantları doğuş zamanı çox az dərəcədə ekspressiya olunmuş olur, lakin doğuşdan sonra beta zəncirin ekspressiyası artmış olur.
  • Delta qlobin zəncirinin variantları dölün inkişafı dövründə çox az dərəcədə ekspressiya olunmuş olur.

İLKİN MÜAYİNƏ.
Hazırda 1000-dən çox hemoqlobin variantları mövcuddur ki, bunların böyük əksəriyyəti kliniki və hematoloji problemlər yaratmır. Lakin, bəzi hallarda xüsusilə də, endemik regionlarda (məs., Azərbaycan, Orta şərq) laborator analizlərdə və ya xəstəliyin klinikasında hemoqlobinopatiyaya şübhə yarandıqda laboratoriyalar tərəfindən dəqiqləşdirmənin aparılması tələb olunur. Bu cür hallarda laboratoriyalar hemoqlobin variantının olub olmamasını, kliniki və/və ya hematoloji fenotipdə oynadığı rolu müəyyən etməyə yardımçı olur. Ümumiyyətlə, hemoqlobinopatiyaların laborator diaqnostikasında xüsusi alqoritmdən istifadə müayinə prosesini asanlaşdırır.

-----------------------------------------------------------------------------------
Cədvəl 2. Hemoqlobinopatiyaların müayinəsinə dair protokol.
  • Kliniki müayinə (anemiya, polisitemiya, sianoz)
  • Qanın ümumi analizi, retikulosit sayı, qanın periferik yaxması, Hayzn cismlərin təyini testi.
  • Selluloza asetatda elektroforez +\- sitrat aqarında elektroforez;
  • Mutasiyaya uğramış Hb-nin ayrılması və təyin edilməsi üçün HPLC (high performance liquid chromotography - yüksək effektivlikli maye xromotoqrafiyası) metodları
    • Kationların mübadiləsi HPLC
    • Geriyə dönmə fazası HPLC (qlobin zəncirinin ayrılması)
  • Xüsusi testlər
    • İzopropanol, istilikdə stabillik (qeyri-stabil HbS)
    • Oksigenə yaxınlıq (birləşmə qabiliyyəti) (p50)
  • DNT əsaslı testlər
    • Qlobin genin amplifikasiyası və ardıcıllığının PZR metodu ilə müəyyən edilməsi
    • Silinmələrin PZR metodu ilə təyin edilməsi.
-----------------------------------------------------------------------------------

Xüsusilə vurğulanmalıdır ki, hemoqlobinopatiyaya şübhə olduqda xəstənin müayinəsi kliniki məlumat və hematoloji mənzərənin qiymətləndirilməsindən başlanmalıdır. Belə ki, anemiyanın olub olmaması, anemiyanın növü və ya eritrositoz, qırmızı qan hüceyrələrinin sayı və xüsusiyyətləri (xüsusi diqqət MCV - orta korpuskulyar həcmə yetirilməlidir), qanın periferik yaxması ilkin müayinənin tərkib hissəsi olmalıdır və sonrakı laborator testlərin aparılmasını istiqamətləndirməlidir.

Hemoqlobin elektroforezi.
Hemoqlobinopatiyaların təyin edilməsində ən geniş istifadə edilən metod hemoqlobin elektroforezidir. İlkin müayinə selluloza asetat üzərində aparılır. Bu sadə metodla normal hemoqlobinləri, HbA, HbF və HbA2-ni və həmçinin geniş yayılmış HbS və HbC variantlarını müəyyən etmək mümkündür. Selluloza asetat zolağında HbA və onun ardınca HbF, HbS və HbC anoda tərəf miqrasiya edir. Bu metodun sadə, ucuz və hemoqlobin variantlarının təyin edilməsində sürətli metod olmasına baxmayaraq onun bəzi məhdudiyyətləri də vardır. Belə ki, selluloza asetat zolağında bir çox digər hemoqlobin variantları HbS və HbC ilə birgə miqrasiya etmiş olur və nəticədə onların müəyyən edilməsi çətinləşir. Məsələn, HbS kimi oxşar hərəkətliliyə malik bir neçə hemoqlobin variantları vardır ki, bunlarda HbD, HbG və Hb Lepore aiddir. HbC ilə birgə isə HbE və HbO-Arab variantları miqrasiya edir.
Bəzi hemoqlobin variantlarının yanaşı miqrasiyası səbəbindən selluloza asetat zolağında aparılmış elektroforezdən sonra çox vaxt ikinci elektroforez proseduru - sitrat aqarında turş mühitdə elektroforez keçirilir. Bu metod həm hemoqlobin molekullarının elektrik yüklülüyünə, həm də elektroforez mühiti ilə molekulların kmiyəvi qarşılıqlı əlaqəsinə əsaslanır.
  • sitrat aqarında HbF, HbA, HbS və HbC fərqli hərəkətlilik xüsusiyyətinə malikdir və bu selluloza asetat zolağında müşahidə edilən hərəkətlilikdən fərqlənir.
  • selluloza asetat mühitində HbD və HbG variantları HbS ilə birgə miqrasiya edir, lakin sitrat aqarında bu variantların hərəkətlilik səviyyəsi HbA ilə eynidir.
  • sitrat aqarında HbE HbA ilə birgə miqrasiya edir, lakin HbO-Arab variantının hərəkətlilik səviyyəsi bunlardan fərqlənir (HbA ilə HbS arasında).
Buna görə də, selluloza asetat mühiti və sitrat aqarı mühitində elektroforezin tətbiqi HbS, HbC, HbE və HbO-Arab hemoqlobin variantlarının daha düzgün təyin edilməsinə imkan verir.

İzoelektrik fokuslaşma metodu.
Qeyd edilməlidir ki, bir çox hallarda selluloza asetat və sitrat aqar zolağında elektroforez əvəzində aqaroza gelində izoelektrik fokuslaşma metodu geniş istifadə edilir.

Yüksək effektivlikli maye xromatoqrafiyası.
  • Kationlar mübadiləsi. Qeyri-normal hemoqlobin variantlarının müəyyən edilməsində növbəti addım adətən kationların mübadiləsi metodudur. Bu metodla beta-zənciri fərqli olan hemoqlobin variantlarının - HbS, HbC, HbE, HbD-Los Angeles və HbO-Arab - diaqnostikası həyata keçirilir. Bu metod həm də alfa zəncirində fərq olan hemoqlobin variantlarının - HbG-Philadelphia - təyin edilməsində faydalıdır. Ümumiyyətlə, kationların mübadiləsinə əsaslanan yüksək effektivlikli maye xromatoqrafiyası metodu ilə kiçik betta-talassemiya, habelə digər beta-talassemiya sindromlarının və həmçinin irsi fetal HbF xəstəliyinin ilkin diaqnostikası mümkündür.

PZR amplifikasiya metodu.
Qeyri-normal hemoqlobinin mövcudluğunu müəyyən etmək üçün diaqnostik yanaşmanın son addımı isə məlum olmayan və ya çox nadir təsadüf edən hemoqlobin variantlarının təyin edilməsidir. Buna nail olmaq üçün sual altında olan qlobin geninin PZR amplifikasiyası metodu istifadə edilir.

HEMOQLOBİNOPATİYALARA DAİR MÜAYİNƏYƏ GÖSTƏRİŞLƏR.
  • Mikrositik hipoxromik anemiya (dəmir defisiti istisna olunduqdan sonra)
  • Xroniki hemolitik anemiya
  • HbS və/və ya HbC hemoqlobin variantlarının geniş yayıldığı coqrafi ərazilərdə naməlum səbəbdən damar mənfəzinin obliterasiyası nəticəsində işemik böhran hadisəsi
  • Dərman qəbulu səbəbindən inkişaf edən anemiya
  • Hematoloji faktorlar səbəbindən inkişaf etmiş eritrositoz və/və ya sianoz
  • Hidrops fetalis (naməlum səbəbdən)
  • Profilaktika (genetik məsləhətləşmə, ailə üzvlərində aparılan laborator müayinələr)
  • Prenatal diaqnostika.

GENİŞ YAYILMIŞ TALASSEMİYA SİNDROMLARI.

Alfa-talassemiya. Alfa talassemiyanın 4 kliniki növü vardır ki, bunlarda alfa-zənciri kodlaşdıran genlərin itirilməsindən irəli gəlir:
  • Alfa-talassemiya minima (heteroziqot alfa+ talassemiya, -α/αα): qanın ümumi analizində əhəmiyyətli dəyişikliklər müşahidə edilir (bəzən mülayim dərəcəli hipoxromiya müəyyən edilir).
  • Alfa-talassemiya minor (heteroziqot alfa0 talassemiya, --/αα və ya homoziqot alfa+ talassemiya, -α/-α): bu xəstələrdə mülayim dərəcəli anemiya, hipoxromiya, mikrositoz müəyyən edilir.
  • HbH xəstəliyi (üç qeyri-aktiv genlə heteroziqot alfa+/alfa0 talassemiya, --/-α): orta dərəcəli hipoxromik hemolitik anemiya, splenomeqaliya. Virus infeksiyaları və bəzi dərmanlar səbəbindən anemik kriz halları müşahidə edilir. Bu xəstələrdə həm də ürək problemləri, öd daşları, aşağı ətraflarda xoralar və foli turşusunun çatışmazlığı da müşahidə edilir.
  • Hb Bart hidrops fetalis (homoziqot alfa0-talassemiya, --/--): ciddi hemolitik anemiya ilə müşahidə edilən bu hemoqlobinopatiya hələ dölün ana bətnində olduğu dövrdə müəyyən edilir. Bu xəstələrdə alfa-qlobin zəncirlərinin sintezi ümumiyyətlə baş vermir. Kliniki cəhətdən xəstələrdə hidrops və assit müəyyən edilir. Bu xəstəlik müalicə olunmadıqda ölümlə nəticələnir.

Beta-talassemiya. Beta-talassemiya sindromları beta-qlobin zəncirlərinin sintezi səviyyəsindən asılı olaraq klassifikasiya olunur. Bu sindromların inkişafı beta-qlobin zəncirini kodlaşdıran genlərin mutasiyası səbəbindən baş verir.
  • Talassemiya minor (kiçik betta-talassemiya): mülayim dərəcəli, mikrositik hipoxromik anemiya.
  • Talassemiya intermedia (orta ağır talassemiya): bu xəstələr qan transfuziyasından asılı olsalar da, bu asılılıq daha az dərəcədədir.
  • Talassemiya major (böyük talassemiya): bu xəstələr uzun müddətli transfuziyalardan asılıdır. Böyük beta-talassemiyanın müalicəsi aparılmadıqda, ondan əziyyət çəkən uşaqlar nadir hallarda 10 yaşından çox yaşıyır. Böyük beta talassemiyası olan xəstələrin müalicəsi bir sıra ağırlaşmalarla müşaiyət olunur - dəmirlə artıq yüklənmə və çox saylı hədəf orqanların zədələnməsi. Bir çox qərb ölkələrində aparılan müalicə nəticəsində böyük beta talassemiyası olan xəstələr adətən 50-60 yaşadək sağ qala bilir.